Proteomika – okruhy ke státní zkoušce | Laboratory of growth regulators

Proteomika – znalosti by měly pokrývat oblasti použití moderních biochemických a analytických technik ke kvalitativní a kvantitativní charakterizaci peptidů a proteinů v biologických materiálech.

Peptidové mapování (PMF) – příprava vzorků a postup identifikace proteinů, základní charakteristiky a omezení tohoto přístupu? Popište způsob interpretace získaných spekter a jejich použití pro identifikaci proteinů (vyhledávací algoritmy a databáze). Uveďte přístroje, které se u toho přístupu využívají a proč?
Peptidové sekvenování (PS, MS/MS) – příprava vzorků, postup identifikace peptidů a proteinů, základní charakteristiky tohoto přístupu. Popište způsob interpretace získaných spekter a jejich použití pro identifikaci proteinů (vyhledávací algoritmy a databáze). Uveďte přístroje, které se u tohoto přístupu používají a proč?
Analýza proteinů a jejich vlastností. Uveďte metody umožňující analýzu molekulové hmotnosti proteinů a jejich isoelektrické vlastnosti. Vysvětlete rozdíly při stanovení molekulové hmotnosti proteinů při použití MALDI a ESI ionizace.
Frakcionace proteinů a peptidů na základě specifických vlastností (velikost, hydrofóbicita, náboj, biospecifita). Vysvětlete principy metod, uspořádání a jejich použití v proteomice. Analýza makromolekulárních komplexů – přístupy a metody.
Isoelektrická fokusace. Vysvětlete princip metody, uspořádání, provedení a vlastnosti. Popiše použití pro analýzu peptidů a proteinů, možnosti uspořádání pro analytické a preparativní účely, uveďte způsoby identifikace proteinů po dělení. Vysvětlete pojmy spojené s isoelektrickou fokusací.
Polyakrylamidová elektroforéza. Vysvětlete princip metody, uspořádání, provedení a vlastnosti. Popiše použití pro analýzu peptidů a proteinů, možnosti uspořádání pro analytické a preparativní účely, uveďte způsoby identifikace proteinů po dělení. Vysvětlete pojmy spojené s polyakrylamidovou elektroforézou.
Dvoudimenzionální polyakrylamidová elektroforéza. Vysvětlete princip uspořádání techniky, vlastnosti, použití v proteomice, uveďte způsoby identifikace proteinů po dělení. Vysvětlete techniku DIGE, uveďte princip, výhody, provedení a použití.
Multidimenzionální techniky dělení proteinů a peptidů. Vysvětlete princip multidimenzionálních technik, důvody použití. Uveďte příklady postupů pro dělení proteinů a peptidů, vysvětlete důvody pro uvedené příklady.
Fragmentace peptidů. Popište nomenklaturu štěpení peptidů během fragmentace. Uveďte techniky fragmentace peptidů v hmotnostní spektrometrii, vysvětlete principy jednotlivých fragmentačních technik, jejich vlastnosti, typy produkovaných iontových sérií a použití.
Ionizační techniky v hmotnostní spektrometrii využívané v proteomice. Vysvětlete principy MALDI a ESI ionizace peptidů a proteinů, jejich vlastnosti a využití. Objasněte postup přípravy vzorků pro jednotlivé ionizační techniky.
Kvantitativní proteomika. Vysvětlete princip provedení, uveďte rozdělení metod pro kvantitativní proteomiku, popište ideální standard. Popište metodu absolutní kvantifikace proteinu a peptidu v proteomice a metody kvantifikace bez izotopicky znacených standardu (labelfree metody). Srovnejte výhody a nevýhody různých přístupů ke značení proteinů a peptidů v kvantitativní proteomice.
Kvantitativní proteomika. Popište metody metabolického a chemického izotopického značení a enzymatického značení proteinů a peptidů v proteomice. Uveďte výhody a nevýhody jednotlivých metod a jejich použití.

Proteomika, peptidomika – definice, přehled, vysvětlení pojmů, cíle, komplexita a dynamičnost proteomu. Strategie analýzy peptidů a proteinů (Bottom-up, Shotgun, Top-down) – principy uspořádání, rozdíly, využití. Základní postupy přípravy vzorků pro proteomickou analýzu (pufry pro nativní nebo denaturační analýzu, inhibitory proteáz, denaturanty, reduktans) – vysvětlení důvodů použití. Metody prefrakcionace komplexních směsí proteinů (konvenční biochemické, biospecifické)-rozdělení, principy metod, využití. Elektroforetické metody analýzy proteinů – isoelektrická fokusace (isoelektrický bod proteinu, fokusační efekt, amfolyty, uspořádání IEF, IPG stripy) – vlastnosti, příprava, použití, podmínky provedení IEF, detekce proteinů); nativní, denaturační a redukující elektroforéza (principy technik, principy provedení, rozdíly, uspřádání, využití, detekce proteinů); dvoudimenzionální elektroforéza (princip metody, princip provedení, upořádání, omezení a využití). Štěpení proteinů pro identifikaci pomocí MS metod (typy enzymů a jejich dělení, princip štěpení proteinů a postupy při štěpení v gelu a v roztoku). Multidimenzionální techniky identifikace peptidů a proteinů (princip kapalinové chromatografie, dělení typů kapalinové chromatografie, principy sil a efektů ovlivňující dělení a aplikace v peptidové a proteinové analýze); multidimenzionální techniky (MuD) – princip uspořádání, důvody použití, typy kombinací technik, píková kapacita, typy propojení + výhody a nevýhody, MuD techniky pro dělení proteinů a peptidů. Hmotnostní spektrometrie (princip, vlastnosti, schéma MS přístroje, základní procesy v MS, ionizační techniky ESI, MALDI, vlastnosti, použití, typy hmotnostních analyzátorů –kvadrupol, iontová past, analyzátor doby letu, OrbiTrap – vlastnosti, použití, princip; tandemové hmotnostní analyzátory + principy, aplikace, využití). Metody excitace a fragmentace peptidů – CAD/CID, ETD, ECD, HCD, PQD – rozdíly, využití, nomenklatura štěpení peptidů. Interpretace hmotnostních spekter v proteomice (hmotnostní spektrum, kvazimolekulární ionty, monoizotopická a průměrná hmotnost, izotopické píky, určování náboje iontů, stanovení rozlišení přístroje). Metody identifikace peptidů a proteinů – Peptide Mass Fingerprinting (PMF) a pomocí peptidového sekvenování „Data dependent/independent analysis“, příprava a analýza vzorků pomocí MALDI a ESI ionizace, čistění peptidů na RP fázích, MALDI matrice – princip použití, vlastnosti, aplikace v proteomice). Interpretace MS dat v proteomice (určení molekulové hmotnosti proteinů pomocí MALDI a ESI ionizace – rozdíly, databázové vyhledávací algoritmy pro identifikace peptidů a proteinů – principy, rozdíly, použití; zdroje a typy databází pro proteomiku). Kvantifikace v proteomice (důvody, ideální standard pro MS, dělení přístupů a technik pro kvantifikaci proteinů a peptidů, rozdíly, výhody vs nevýhody, aplikace – relativní vs. absolutní, in vitro vs in vivo značení, 2D elektroforéza, metabolické isotopické, enzymatické a chemické značení, absolutní kvantifikace AQUA, labelfree kvantifikace).